蛋白类或抗体类药物的免疫原性检测中，如药物的靶点为二聚体或多聚体，可能造成假阳性结果，影响免疫原性检测的准确性，而消除靶点的干扰需要加入封闭靶点的抗体，或通过抗体吸附作用去除靶点，这两种方法因为涉及抗体的制备和筛选，耗时长且不易成功。免疫原性分析中还存在另一难点：药物耐受，即给药后血清中的高浓度药物对抗药抗体检测的干扰作用，造成假阴性的检测结果。本实验室为解决双特异性抗体DT免疫原性分析中的靶点干扰和药物耐受问题，采用交联药物的琼脂糖亲和纯化对样品进行预处理，之后采用桥接ECL方法检测抗药抗体，解决靶点干扰的同时大大提高了方法的药物耐受度。
关键词：Bispecificantibody；免疫原性；靶点干扰；假阳性；药物耐受。
材料和方法
将双特异性抗体DT交联到琼脂糖（CNBr-activatedSepharoseTM4B）上，血清样品和交联DT的琼脂糖共同孵育，样品中的抗药抗体和琼脂糖上交联的DT结合，清洗后加入乙酸溶液解离得到含抗药抗体的上清，将其和生物素标记的DT、钌标的DT、碱性溶液共同孵育，形成复合物后加入包被Streptavidin的MSD板，桥连复合物中的biotin和Streptavidin特异性结合，通过洗板去除没有结合的物质后，加入含有三丙胺的Readbuffer，通过电压激发钌产生与样品中抗药抗体浓度成正比的电化学信号。
图1.琼脂糖预处理检测流程示意图
结果
（1）靶点干扰的去除作用
如不采用预处理，不同食蟹猴个体空白血清样品检测的信号值差异较大，经琼脂糖纯化处理后所有信号值异常高的个体食蟹猴血清样品信号值均降至较低的水平，如下表所列8个个体食蟹猴血清正常检测情况下检测信号值在~范围内；经琼脂糖纯化处理后，信号值在73~范围内。
表1.个体血清处理前后对比数据
个体
血清
处理前信号值1
处理后信号值1
处理前信号值2
处理后信号值2
血清1
80
血清2
84
血清3
73
血清4
78
血清5
血清6
93
3
血清7
80
血清8
92
注：1表示空白血清，2表示在相应的个体血清中添加50ng/mL阳性对照抗体。
（2）药物耐受水平的提高
表2.处理前后药物耐受对比数据
样品
处理前
信号值
处理后
信号值
HPC（ng/mL）
LPC（20ng/mL）
NC（0ng/mL）
81
HPC（ng/mL）+DT（μg/mL）
LPC（20ng/mL）+DT（10μg/mL）
注：“HPC”高浓度对照样品；“LPC”表示低浓度对照样品。
（3）药物耐受考察结果
DT浓度
（μg/mL）
HPC
LPC
信号值均值
信号值复孔%CV
Results
信号值均值
信号值复孔%CV
Results
2.06
positive
89
1.59
negative
1.79
positive
90
1.57
negative
1.09
positive
90
0.79
negative
0.88
positive
90
0.00
negative
3.62
positive
93
1.52
negative
62.5
0.94
positive
0.00
negative
31.25
0.12
positive
1.27
positive
15.63
1.98
positive
3.86
positive
7.81
2.93
positive
0.60
positive
3.91
5.81
positive
0.00
positive
1.95
3.65
positive
1.20
positive
0.98
3.87
positive
2.34
positive
SCP
注：上表中Results项“positive”表示该样品信号值均值≥SCP，“negative”表示该样品信号值均值SCP。
由上表可见，HPC（ng/mL）水平的阳性对照抗体能耐受血清样品中μg/mL的DT干扰，LPC（20ng/mL）水平的阳性对照抗体能耐受血清样品中31.25μg/mL浓度的DT干扰，该方法可达到：1（药物：阳性抗体浓度）以上的药物耐受水平，可以满足毒理试验血清样品中抗药抗体的检测需求。
结论
采用交联药物的琼脂糖亲和纯化对样品进行预处理的方法，可以有效解决靶点干扰造成的灵敏度明显降低、假阳性等问题，另外很大程度提高了方法的药物耐受度，可应用于免疫原性分析方法中靶点干扰、药物耐受问题的解决。
作者：何凤霞阮海文张雪峰
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